化學(xué)藥物質(zhì)量控制分析方法驗(yàn)證技術(shù)指導(dǎo)原則

一、概述

保證藥品安全、有效、質(zhì)量可控是藥品研發(fā)和評價應(yīng)遵循的基本原則，其中，對藥品進(jìn)行質(zhì)量控制是保證藥品安全有效的基礎(chǔ)和前提。為達(dá)到控制質(zhì)量的目的，需要多角度、多層面來控制藥品質(zhì)量，也就是說要對藥物進(jìn)行多個項(xiàng)目測試，來全面考察藥品質(zhì)量。一般地，每一測試項(xiàng)目可選用不同的分析方法，為使測試結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，必須對所采用的分析方法的科學(xué)性、準(zhǔn)確性和可行性進(jìn)行驗(yàn)證，以充分表明分析方法符合測試項(xiàng)目的要求，這就是通常所說的對方法進(jìn)行驗(yàn)證。 方法驗(yàn)證的目的是判斷采用的分析方法是否科學(xué)、合理，是否能有效控制藥品的內(nèi)在質(zhì)量。

從本質(zhì)上講，方法驗(yàn)證就是根據(jù)檢測項(xiàng)目的要求，預(yù)先設(shè)置一定的驗(yàn)證內(nèi)容，并通過設(shè)計(jì)合理的試驗(yàn)來驗(yàn)證所采用的分析方法能否符合檢測項(xiàng)目的要求。

方法驗(yàn)證在分析方法建立過程中具有重要的作用，并成為質(zhì)量研究和質(zhì)量控制的組成部分。

只有經(jīng)過驗(yàn)證的分析方法才能用于控制藥品質(zhì)量，因此方法驗(yàn)證是制訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)。方法驗(yàn)證是藥物研究過程中的重要內(nèi)容。

二、方法驗(yàn)證的一般原則

原則上每個檢測項(xiàng)目采用的分析方法，均需要進(jìn)行方法驗(yàn)證。

方法驗(yàn)證的內(nèi)容應(yīng)根據(jù)檢測項(xiàng)目的要求，結(jié)合所采用分析方法的特點(diǎn)確定。

同一分析方法用于不同的檢測項(xiàng)目會有不同的驗(yàn)證要求。例如，采用高效液相色譜法用于制劑的鑒別和雜質(zhì)定量試驗(yàn)應(yīng)進(jìn)行不同要求的方法驗(yàn)證，前者重點(diǎn)要求驗(yàn)證專屬性，而后者重點(diǎn)要求驗(yàn)證專屬性、準(zhǔn)確度、定量限。

三、方法驗(yàn)證涉及的三個主要方面

（一）需要驗(yàn)證的檢測項(xiàng)目

鑒別、

雜質(zhì)檢查

定量測定（含量測定、溶出度、釋放度等）、

其他特定檢測項(xiàng)目 （分子量及分子量分布、生物活性等）

鑒別的目的在于判定被分析物是目標(biāo)化合物，而非其它物質(zhì)，用于鑒別的分析方法要求具有較強(qiáng)的專屬性。

雜質(zhì)檢查主要用于控制主成分以外的雜質(zhì)，如有機(jī)雜質(zhì)、無機(jī)雜質(zhì)等。雜質(zhì)檢查可分為限度試驗(yàn)和定量試驗(yàn)兩種情況。用于限度試驗(yàn)的分析方法驗(yàn)證側(cè)重專屬性和檢測限。

用于定量試驗(yàn)的分析方法驗(yàn)證強(qiáng)調(diào)專屬性、準(zhǔn)確度和定量限。

定量測定包括含量測定、制劑的溶出度測定等，由于此類項(xiàng)目對準(zhǔn)確性要求較高，故所采用的分析方法要求具有一定的專屬性、準(zhǔn)確度和線性。

其他特定檢測項(xiàng)目包括粒徑分布、旋光度、分子量分布、生物活性等，由于這些檢測項(xiàng)目的要求與鑒別、雜質(zhì)檢查、定量測定等有所不同，對于這些項(xiàng)目的分析方法驗(yàn)證應(yīng)有不同的要求。

（二）分析方法

分析方法是為完成上述各檢測項(xiàng)目而設(shè)定和建立的測試方法。

分析方法原理

儀器及儀器參數(shù)

試劑

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

供試品溶液制備

對照品溶液制備

測定

計(jì)算及測試結(jié)果的報告等

測試方法

化學(xué)分析方法

儀器分析方法

這些方法各有特點(diǎn)，同一測試方法可用于不同的檢測項(xiàng)目，但驗(yàn)證內(nèi)容可不相

（三）驗(yàn)證內(nèi)容

驗(yàn)證內(nèi)容：

方法的專屬性

線性

范圍

準(zhǔn)確度

精密度

檢測限

定量限

耐用性

系統(tǒng)適用性等

四、方法驗(yàn)證的具體內(nèi)容

（一）專屬性

專屬性系指在其他成分（如雜質(zhì)、降解物、輔料等）可能存在下，采用的分析方法能夠正確鑒定、檢出被分析物質(zhì)的特性。

通常，鑒別、雜質(zhì)檢查、含量測定方法中均應(yīng)考察其專屬性。如采用的方法不夠?qū)伲瑧?yīng)采用多個方法予以補(bǔ)充。

1、鑒別反應(yīng)

鑒別試驗(yàn)應(yīng)確證被分析物符合其特征。

專屬性試驗(yàn)要求證明能與可能共存的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)相似化合物區(qū)分，需確證含被分析物的供試品呈正反應(yīng)，而不含被測成分的陰性對照呈負(fù)反應(yīng)，結(jié)構(gòu)相似或組分中的有關(guān)化合物也應(yīng)呈負(fù)反應(yīng)。

2、雜質(zhì)檢查

作為純度檢查，所采用的分析方法應(yīng)確保可檢出被分析物中雜質(zhì)的含量，如有關(guān)物質(zhì)、重金屬、有機(jī)溶劑等。因此雜質(zhì)檢查要求分析方法有一定的專屬性。

在雜質(zhì)可獲得的情況下，可向供試品中加入一定量的雜質(zhì)，證明雜質(zhì)與共存物質(zhì)能得到分離和檢出，并具適當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確度與精密度。

在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的情況下，專屬性可通過與另一種已證明合理但分離或檢測原理不同、或具較強(qiáng)分辨能力的方法進(jìn)行結(jié)果比較來確定?；?qū)⒐┰嚻酚脧?qiáng)光照射，高溫，高濕，酸、堿水解及氧化的方法進(jìn)行破壞（制劑應(yīng)考慮輔料的影響），比較破壞前后檢出的雜質(zhì)個數(shù)和量。必要時可采用二極管陣列檢測和質(zhì)譜檢測，進(jìn)行色譜峰純度檢查。

3、含量測定

含量測定目的是得到供試品中被分析物的含量或效價的準(zhǔn)確結(jié)果。 在雜質(zhì)可獲得的情況下，對于主成分含量測定可在供試品中加入雜質(zhì)或輔料，考察測定結(jié)果是否受干擾，并與未加雜質(zhì)和輔料的供試品比較測定結(jié)果。

在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的情況下，可采用另一個經(jīng)驗(yàn)證了的或藥典方法進(jìn)行比較，對比兩種方法測定的結(jié)果。

也可采用破壞性試驗(yàn)（強(qiáng)光照射，高溫，高濕，酸、堿水解及氧化），得到含有雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的試樣，用兩種方法進(jìn)行含量測定，比較測定結(jié)果。

必要時進(jìn)行色譜峰純度檢查，證明含量測定成分的色譜峰中不包含其他成分。

（二）線性

線性系指在設(shè)計(jì)的測定范圍內(nèi)，檢測結(jié)果與供試品中被分析物的濃度（量）直接呈線性關(guān)系的程度。 線性是定量測定的基礎(chǔ)，涉及定量測定的項(xiàng)目，如雜質(zhì)定量試驗(yàn)和含量測定均需要驗(yàn)證線性。 應(yīng)在設(shè)計(jì)的測定范圍內(nèi)測定線性關(guān)系?？捎靡毁A備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密稱樣，制備一系列被測物質(zhì)濃度系列進(jìn)行測定，至少制備5個濃度。以測得的響應(yīng)信號作為被測物濃度的函數(shù)作圖，觀察是否呈線性，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。 必要時，響應(yīng)信號可經(jīng)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，再進(jìn)行線性回歸計(jì)算，并說明依據(jù)。

（三）范圍

范圍系指能夠達(dá)到一定的準(zhǔn)確度、精密度和線性，測試方法適用的試樣中被分析物高低限濃度或量的區(qū)間。 范圍是規(guī)定值，在試驗(yàn)研究開始前應(yīng)確定驗(yàn)證的范圍和試驗(yàn)方法。

可以采用符合要求的原料藥配制成不同的濃度，按照相應(yīng)的測定方法進(jìn)行試驗(yàn)。 范圍通常用與分析方法的測試結(jié)果相同的單位（如百分濃度）表達(dá)。涉及到定量測定的檢測項(xiàng)目均需要對范圍進(jìn)行驗(yàn)證，如含量測定、含量均勻度、溶出度或釋放度、雜質(zhì)定量試驗(yàn)等。

范圍應(yīng)根據(jù)劑型和（或）檢測項(xiàng)目的要求確定。

1、含量測定 范圍應(yīng)為測試濃度的80％～100％或更寬。

2、制劑含量均勻度 范圍應(yīng)為測試濃度的70％～130％。根據(jù)劑型特點(diǎn)，如氣霧劑、噴霧劑，必要時，范圍可適當(dāng)放寬。

3、溶出度或釋放度 對于溶出度，范圍應(yīng)為限度的±20％；如規(guī)定限度范圍，則應(yīng)為下限的-20％至上限的+20％。 對于釋放度，如規(guī)定限度范圍為，從1小時后為20％至24小時后為90％，則驗(yàn)證范圍應(yīng)為0～110％。

4、雜質(zhì) 雜質(zhì)測定時，范圍應(yīng)根據(jù)初步實(shí)測結(jié)果，擬訂出規(guī)定限度的±20％。如果含量測定與雜質(zhì)檢查同時測定，用面積歸一化法，則線性范圍應(yīng)為雜質(zhì)規(guī)定限度的-20％至含量限度（或上限）的+20％。

（四）準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度系指用該方法測定的結(jié)果與真實(shí)值或認(rèn)可的參考值之間接近的程度。有時也稱真實(shí)度。 一定的準(zhǔn)確度為定量測定的必要條件，因此涉及到定量測定的檢測項(xiàng)目均需要驗(yàn)證準(zhǔn)確度，如含量測定、雜質(zhì)定量試驗(yàn)等。準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)建立，對于制劑一般以回收率試驗(yàn)來進(jìn)行驗(yàn)證。試驗(yàn)設(shè)計(jì)需考慮在規(guī)定范圍內(nèi)，制備3個不同濃度的試樣，各測定3次，即測定9次，報告已知加入量的回收率（％）或測定結(jié)果平均值與真實(shí)值之差及其可信限。

1、含量測定

原料藥可用已知純度的對照品或符合要求的原料藥進(jìn)行測定，或用本法所得結(jié)果與已建立準(zhǔn)確度的另一方法測定的結(jié)果進(jìn)行比較。 制劑可用含已知量被測物的各組分混合物進(jìn)行測定。如不能得到制劑的全部組分，可向制劑中加入已知量的被測物進(jìn)行測定，必要時，與另一個已建立準(zhǔn)確度的方法比較結(jié)果。

2、雜質(zhì)定量試驗(yàn)

雜質(zhì)的定量試驗(yàn)可向原料藥或制劑中加入已知量雜質(zhì)進(jìn)行測定。如果不能得到雜質(zhì)，可用本法測定結(jié)果與另一成熟的方法進(jìn)行比較，如藥典方法或經(jīng)過驗(yàn)證的方法。 如不能測得雜質(zhì)的相對響應(yīng)因子，可在線測定雜質(zhì)的相關(guān)數(shù)據(jù)，如采用二極管陣列檢測器測定紫外光譜，當(dāng)雜質(zhì)的光譜與主成分的光譜相似，則可采用原料藥的響應(yīng)因子近似計(jì)算雜質(zhì)含量（自身對照法）。并應(yīng)明確單個雜質(zhì)和雜質(zhì)總量相當(dāng)于主成分的重量比（％）或面積比（％）。

（五）精密度

精密度系指在規(guī)定的測試條件下，同一均質(zhì)供試品，經(jīng)多次取樣進(jìn)行一系列檢測所得結(jié)果之間的接近程度（離散程度）。

精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。取樣測定次數(shù)應(yīng)至少6次。

精密度可以從三個層次考察：

重復(fù)性

中間精密度

重現(xiàn)性

1、重復(fù)性

重復(fù)性系指在同樣的操作條件下，在較短時間間隔內(nèi)，由同一分析人員測定所得結(jié)果的精密度。 重復(fù)性測定可在規(guī)定范圍內(nèi)，至少用9次測定結(jié)果進(jìn)行評價，如制備3個不同濃度的試樣，各測定3次，或100％的濃度水平，用至少測定6次的結(jié)果進(jìn)行評價。

2、中間精密度

中間精密度系指在同一實(shí)驗(yàn)室，由于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部條件改變，如時間、分析人員、儀器設(shè)備、測定結(jié)果的精密度。 驗(yàn)證設(shè)計(jì)方案中的變動因素一般為日期、分析人員、設(shè)備。

3、重現(xiàn)性

指不同實(shí)驗(yàn)室之間不同分析人員測定結(jié)果的精密度。 當(dāng)分析方法將被法定標(biāo)準(zhǔn)采用時，應(yīng)進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)。

（六）檢測限

檢測限系指試樣中的被分析物能夠被檢測到的最低量，但不一定要準(zhǔn)確定量。 該驗(yàn)證指標(biāo)的意義在于考察方法是否具備靈敏的檢測能力。因此對雜質(zhì)限度試驗(yàn)，需證明方法具有足夠低的檢測限，以保證檢出需控制的雜質(zhì)。

六、對方法驗(yàn)證的評價

（一）有關(guān)方法驗(yàn)證評價的一般考慮

總體上，方法驗(yàn)證應(yīng)圍繞驗(yàn)證目的和一般原則來進(jìn)行，方法驗(yàn)證內(nèi)容的選擇和試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案應(yīng)系統(tǒng)、合理，驗(yàn)證過程應(yīng)規(guī)范嚴(yán)謹(jǐn)。 并非每個檢測項(xiàng)目的分析方法都需進(jìn)行所有內(nèi)容的驗(yàn)證，但同時也要注意驗(yàn)證內(nèi)容應(yīng)充分，足以證明采用的分析方法的合理性。如雜質(zhì)限度試驗(yàn)一般需要驗(yàn)證專屬性和檢測限，而對于精密度、線性、定量限等涉及定量測定的項(xiàng)目，則一般不需要進(jìn)行驗(yàn)證。

（二）方法驗(yàn)證的整體性和系統(tǒng)性

方法驗(yàn)證內(nèi)容之間相互關(guān)聯(lián)，是一個整體。因此不論從研發(fā)角度還是評價角度，方法驗(yàn)證均注重整體性和系統(tǒng)性。 例如，對于鑒別項(xiàng)目所需要的專屬性，一般一種分析方法不太可能完全鑒別被分析物，此時采用兩種或兩種以上分析方法可加強(qiáng)鑒別項(xiàng)目的整體專屬性。在方法驗(yàn)證內(nèi)容之間也存在較多的關(guān)聯(lián)性，可以相互補(bǔ)充。如原料藥含量測定采用容量分析法時，由于方法本身原因，專屬性略差，但假如在雜質(zhì)檢測時采用了專屬性較強(qiáng)的色譜法，則一般認(rèn)為整個檢測方法也具有較強(qiáng)的專屬性。

總之，由于實(shí)際情況較復(fù)雜，在方法驗(yàn)證過程中，不提倡教條地去進(jìn)行方法驗(yàn)證。

此外，越來越多的新方法不斷被用于質(zhì)量控制中，對于這些方法如何進(jìn)行驗(yàn)證需要具體情況具體分析，而不能照搬指導(dǎo)原則。